文獻賞析

華盈視角:中醫腫瘤研究所陳文連/賈立軍團隊發現果糖代謝轉運蛋白GLUT5促進肺癌惡性生長“雙重機制”

2020/02/19


肺癌(LC)是一種高度致命的惡性腫瘤,它的快速生長需要主要代謝燃料的過度分解代謝。然而,LC細胞為了保持葡萄糖代謝活性而大量消耗葡萄糖,必然會導致腫瘤微環境中的葡萄糖不足,這對LC細胞是不利的。因此,這些惡性細胞需要替代代謝燃料。目前尚不清楚果糖(飲食中的一種豐富的糖)是否承擔這一角色。

華盈生物合作伙伴上海中醫藥大學附屬龍華醫院陳文連/賈立軍教授聯合研究團隊最新發現,果糖轉運體GLUT5在肺癌轉移患者腫瘤組織中高表達,并介導了果糖代謝通路的激活,進而抑制細胞能量感受器AMPK,并活化其下游的mTORC1信號通路,促進肺癌細胞惡性生長的新機制,相關研究成果于2020年2月初發表于國際期刊《JCI Insight》上。

 

本研究選用了華盈生物的PEX100磷酸化廣譜篩選抗體芯片技術

 


1. 代謝組學:分析肺癌病人異常果糖代謝現象


為了評估體內LC的果糖代謝活性,作者招募了ADC(n=22)和SCC(n=13)兩類LC患者(圖1A),并對這些患者的腫瘤組織和癌旁正常組織進行了代謝組學研究。研究發現在LC組織中,果糖水平、果糖與葡萄糖的比率以及果糖衍生的代謝物,包括1-磷酸果糖和磷酸二羥丙酮(DHAP)均升高(圖1B,1C)。因此,作者假設在體內,當葡萄糖缺乏時,LC細胞可以改用循環中的果糖。

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圖1 體內LC果糖利用活性的研究




為了驗證這一假說,作者進行了體外果糖攝取實驗。當培養基葡糖糖充足(6 mM)時,正常組織(N)和腫瘤組織(T)均表現出低果糖攝取率。而當葡萄糖含量低或缺乏時,T顯著上調其果糖消耗率(圖1D)。這些結果表明,果糖是一種供選擇的碳源,在限糖條件下,LC組織的果糖代謝增強,而與之相對的正常組織則沒有表現出這種果糖成癮的特征。

 

2. TCGA分析:發現果糖轉運蛋白GLUT5 在肺癌腫瘤組織中高表達

果糖主要通過兩個主要的果糖轉運蛋白GLUT2和GLUT5進入細胞,這兩個轉運蛋白分別由溶質載體家族2成員2和5(SLC2A2和SLC2A5)編碼。研究人員對比了腫瘤基因組圖譜(TCGA)數據庫中的RNA-Seq數據和基因表達譜芯片數據,發現SLC2A2在ADC和SCC患者的LC組織中的表達沒有明顯變化(圖2A,2B),而SLC2A5卻顯著上調(圖2C,2D)。作者的Western結果也顯示SLC2A5的蛋白產物GLUT5表達水平也顯著升高(圖2E,2F)。


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圖2  LC患者組織中GLUT2和GLUT5表達情況



3. 臨床樣本IHC:發現GLUT5蛋白高表達與預后呈負相關

此外,作者還對ADC和SCC兩類LC患者進行免疫組織化學(IHC)檢測,結果發現GLUT5在LC患者組織中表達上調(圖3A,3B)。值得注意的是,IHC染色表明GLUT5高表達的LC患者生存預后不良(圖3C,3D)。


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圖3 LC組織和正常組織中GLUT5表達情況

4. 果糖代謝分析:發現GLUT5直接影響果糖攝取并促進LC細胞增殖


隨后,為了驗證GLUT5是否介導了體內LC的果糖攝取,作者對A549和EKVX細胞進行SCL2A5基因敲除(圖4A)。體外實驗中,發現SLC2A5缺失顯著抑制果糖攝取和果糖誘導的細胞增殖,而對葡萄糖攝取和葡萄糖誘導的細胞增殖影響不大(圖4B,4C)。體內實驗中,代謝流技術觀察發現移植瘤SLC2A5缺失可降低13C-果糖水平并抑制LC異種移植瘤的生長(圖4,D-F)。


 


圖4 SLC2A5缺失對LC細胞果糖攝取及增殖影響

 

5. 代謝流分析:GLUT5介導脂肪酸代謝途徑穩定性

為了闡明果糖是否直接參與脂肪酸的合成,作者進行了體內代謝流測定。將1M [U-13C6]-d-fructose通過小鼠尾靜脈注入,并追蹤A549異種移植瘤中的果糖下游代謝產物。結果發現,在缺失SLC2A5的A549腫瘤中,13C-丙酮酸、13C-乙酰輔酶A和13C-棕櫚油酸減少,而在GLUT5過表達的A549腫瘤中,這些代謝物則反向上調(圖5,A和B)。這些發現表明,在肺部腫瘤中,吸收的果糖被用來合成脂肪酸,包括棕櫚油酸。

 

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圖5 SLC2A5對果糖下游脂肪酸代謝途徑的調控

 

6. 抗體芯片:確定GLUT5促進LC惡性增殖信號通路

為了全面了解果糖利用誘導LC生長的分子機制,作者利用華盈生物提供的PEX100磷酸化抗體芯片技術(可篩選31條信號通路)對SLC2A5缺失的A549腫瘤移植瘤和對照組的A549腫瘤移植瘤組織中的磷酸化譜進行廣泛篩選,檢測特定位點的蛋白磷酸化事件,并識別調控LC生長的下游底物/效應物。與對照腫瘤相比,SLC2A5缺失在A549腫瘤中引起了廣泛的磷酸化蛋白譜的變化,其中磷酸化水平升高50%以上的蛋白有82個,磷酸化水平降低50%以上的蛋白有46個。在SLC2A5缺失的A549腫瘤中磷酸化水平改變的蛋白中,以輔酶A羧化酶1(ACC1)的蛋白表達最高,在Ser79處磷酸化水平增加達到838%以上。而ACC1是AMPK眾所周知的下游靶點。相應地,抗體芯片顯示AMPK也被顯著激活,上調1.95倍(圖6A)。前人研究表明,AMPK下游的mTORC1蛋白是促進LC惡性生長的重要調控蛋白。在本研究中,抗體芯片結果顯示受mTORC1調控的兩個最重要的蛋白4E-BP1和p70S6K的磷酸化在SLC2A5缺失的A549腫瘤中也被顯著抑制(圖6A),說明了mTORC1通路受到了GLUT5的調控。作者利用Western blot方法驗證了抗體芯片結果(圖6B)。

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圖6 抗體芯片分析SLC2A5對AMPK/mTORC1信號通路的調控

 

7. Rescue實驗:證實GLUT5直接調控AMPK/mTORC1信號通路

為了進一步證實GLUT5介導的果糖利用可能影響AMPK/mTORC1信號通路,作者將對照組A549細胞和SLC2A5基因敲除的A549細胞在無糖培養基中饑餓2h,以刺激AMPK,抑制mTORC1活性。然后在培養基中分別加入果糖和葡萄糖,最終濃度為6 mM,處理細胞1h。在果糖條件下,對照A549細胞可以用果糖抑制AMPK活性,上調mTORC1活性,而SLC2A5缺失的A549細胞由于喪失了果糖利用能力而沒有表現出這種信號改變(圖7A和B)。此外,為了驗證激活的AMPK是否阻礙LC細胞的生長,作者使用AMPK激動劑AICAR來異常刺激AMPK,從而降低A549細胞中mTORC1的活性(圖7C)??梢园l現A549細胞的增殖受到AICAR處理的顯著抑制(圖7D)??傊?,LC細胞需要GLUT5介導的果糖利用來抑制AMPK,激活mTORC1活性,從而促進LC細胞的生長。

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圖7 GLUT5是激活AMPK/mTORC1通路的主要靶點

 

小結

本研究充分利用了非靶向代謝組學篩選、代謝流、抗體芯片技術(華盈生物均可提供服務)發現了肺癌惡性生長的雙重機制:首先利用代謝組學技術發現了肺癌患者果糖攝入增加的特殊現象,并利用代謝流等技術證實了果糖轉運蛋白GLUT5一方面通過增加果糖攝入,促進脂肪酸合成途徑,為肺癌細胞提供補充能量的明確機制。另一方面GLUT5引起的果糖攝入增加抑制了AMPK的活性,進而促進了mTORC1通路的激活,導致肺癌惡性增殖的機制(圖8)。

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圖8 GLUT5促進肺癌惡性增殖的雙重機制

本研究實驗設計思路清晰,層層遞進;實驗方法應用合理,推陳出新;實驗結果全面可靠,非常值得華盈視角推薦。

  

文獻原文:GLUT5-mediated fructose utilization driveslungcancer growth by stimulating fatty acid synthesis and AMPK/mTORC1 signaling.

 



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